Молекулярно-генетическая диагностика в группе пациентов с гемофилией А в Республике Беларусь: 12 новых аллельных вариантов в гене F8

Гемофилия А является наиболее распространенным тяжелым нарушением свертываемости крови, обусловленным различными генетическими нарушениями в гене F8, приводящими к дефициту VIII фактора свертывания крови. Гемофилия А характеризуется крайне высокой гетерогенностью в отношении генетических нарушений. Степень тяжести гемофилии А варьирует в зависимости от типа нарушения в гене F8. Идентифицировано и описано более 3000 уникальных вариантов гена F8, ассоциированных с фенотипом гемофилии А. При этом примерно 30% генетических нарушений возникают de novo. Цель настоящего исследования – определить спектр генетических нарушений в гене F8 у детей и подростков с гемофилией А в Республике Беларусь. Настоящее исследование одобрено независимым этическим комитетом и утверждено решением ученого совета ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» (Республика Беларусь). В исследование были включены 98 пациентов с клиническим диагнозом гемофилии А, находившихся на обследовании и лечении в ГУ «Республиканский научнопрактический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии» (Республика Беларусь). В зависимости от тяжести заболевания распределение пациентов было следующим: 82 пациента – с тяжелой, 3 – со среднетяжелой и 13 – с легкой формой гемофилии А. У 20 (20,4%) пациентов в анамнезе имелись данные о развитии ингибиторов к VIII фактору свертывания крови. Материалом исследования послужила венозная кровь. Геномную ДНК выделяли стандартным методом фенолхлороформной экстракции из полученной суспензии лейкоцитов. Всем пациентам с тяжелой формой гемофилии А выполняли предскрининг на наличие инверсии 22-го и 1-го интронов гена F8 методами инвертированной и мультиплексной полимеразной цепной реакции соответственно. Секвенирование кодирующих областей гена F8 проводили методом высокопроизводительного секвенирования. Все клинически значимые изменения в нуклеотидной последовательности подтверждали с помощью секвенирования по Сэнгеру. В результате проведенного исследования генетические нарушения в гене F8 были обнаружены у 99% (n = 97) пациентов с гемофилией А. Инверсии 22-го и 1-го интронов гена F8 были детектированы у 45,1% (n = 37) и 1,2% (n = 1) пациентов с тяжелой формой гемофилии А соответственно. У 2 пациентов выявлен аномальный паттерн инверсии 1-го интрона, ранее не описанный в литературе. Высокопроизводительное секвенирование выявило 48 различных генетических нарушений в гене F8 у 57 пациентов. Из 48 обнаруженных генетических нарушений 11 ранее не были описаны в литературных источниках.

1. Pavlova A., Oldenburg J. Defining Severity of Hemophilia: More than Factor Levels. Semin Thromb Hemost 2013; 39 (7): 702–10.

2. Nair P.S., Shetty S.D., Chandrakala S., Ghosh K. Mutations in Intron 1 and Intron 22 Inversion Negative Haemophilia A Patients from Western India. PLoS One 2014; 9 (5): 1–9.

3. Berntorp E., Fischer K., Hart D.P., Mancuso M.E., Stephensen D., Shapiro A.D., et al. Haemophilia. Nat Rev Dis Primers 2021; 7 (45): 45.

4. Feng Y., Li Q., Shi P., Liu N., Kong X., Guo E. Mutation analysis in the F8 gene in 485 families with haemophilia A and prenatal diagnosis in China. Haemophilia 2021; 27 (1): 88–92.

5. Mazurkiewicz-Pisarek A., Płucienniczak G., Ciach T., Płucienniczak A. The factor VIII protein and its function. Acta Biochim Pol 2016; 63 (1): 11–6.

6. McVey J.H., Rallapalli P.M., Kemball-Cook G., Hampshire D.J., Giansily-Blaizot M., Gomez K., et al. The European Association for Haemophilia and Allied Disorders (EAHAD) coagulation factor variant databases: Important resources for haemostasis clinicians and researchers. Haemophilia 2020; 26 (2): 306–13.

7. Azadmehr S., Rahiminejad F., Motlagh F.Z., Jamali M., Tehrani P.G., Shirzadeh T., et al. The Spectrum of Pathogenic Variants in Iranian Families with Hemophilia A. Arch Iran Med 2021; 24 (12): 887–96.

8. Villarreal-Martínez L., IbarraRamirez M., Calvo-Anguiano G., LugoTrampe J.J., Luna-Záizar H., Martínez-de-Villarreal L.E., et al. Molecular genetic diagnosis by next-generation sequencing in a cohort of Mexican patients with haemophilia and report of novel variants. Blood Cells Mol Dis 2020; 83: 102423.

9. Salazar-Sánchez L., Jiménez-Cruz G., Mendez M., Chaverri P., Alvarado P., Schröder W., et al. Molecular analysis of FVIII gene in severe HA patients of Costa Rica. Hamostaseologie 2010; 4: 150–2.

10. Oldenburg J., Pezeshkpoor B., Pavlova A. Historical review on genetic analysis in hemophilia A. Semin Thromb Hemost 2014; 40 (8): 895–902.

11. Schwaab R., Pavlova A., Albert T., Caspers M., Oldenburg J. Significance of F8 missense mutations with respect to inhibitor formation. Thromb Haemost 2013; 109 (3): 464–70.

12. Gouw S.C., Marijke van den Berg H., Oldenburg J., Astermark J., Groot P.G., Margaglione M., et al. F8 gene mutation type and inhibitor development in patients with severe hemophilia A: systematic review and meta-analysis. Blood 2012; 119 (12): 2922–34.

13. Oldenburg J., Pavlova A. Genetic risk factors for inhibitors to factors VIII and IX. Haemophilia 2006; 12: 15–22.

14. Garagiola I., Palla R., Peyvandi F. Risk 2 factors for inhibitor development in severe hemophilia A. Thromb Res 2018; 168: 20–7.

15. Oldenburg J., Pavlova A. Genetic Basis for Inhibitor Development. Current and Future Issues in Hemophilia Care 2011; 79–83.

16. Hay C.R.M., Brown S., Collins P.W., Keeling D.M., Liesner R. The diagnosis and management of factor VIII and IX inhibitots: a guideline from the United Kingdom Hemophilia Centre Doctors Organisation. Br J Haematol 2006; 133: 591–605.

17. Rossetti L.C., Radic C.P., Larripa I.B., De Brasi C.D. Developing a new generation of tests for genotyping hemophilia-causative rearrangements involving int22h and int1h hotspots in the factor VIII gene. J Thromb Haemost 2008; 6: 830–6.

18. Любушкин А.В., Гурьянова И.Е., Дмитриев Е.В., Полякова Е.А., Вертелко В.Р., Алейникова О.В. Частота встречаемости инверсии 22 интрона гена фактора VIII среди пациентов детского возраста в Республике Беларусь. Гематология. Трансфузиология. Восточная Европа 2022; 8 (1): 41–8.

19. Bagnall R.D., Waseem N., Green P.M., Giannelli F. Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene is a frequent cause of severe hemophilia A. Blood 2002; 99 (1): 168–74.

20. Kumar P., Faridi N.J., Husain N., Soni P., Goel S.K. Study of intron 22 inversion mutation in north India with review. Blood Coagul Fibrinolysis 2013; 24 (2): 120–4.

21. Abdulqader A.M.R., Mohammed A.I., Rachid S., Ghoraishizadeh P., Mahmood S.N. Identification of the Intron 22 and Intron 1 Inversions of the Factor VIII Gene in Iraqi Kurdish Patients With Hemophilia A. Clin Appl Thromb Hemost 2020; 26: 1076029619888293.

22. Milena Mantilla-Capacho J., Beltrán-Miranda C.P., Luna-Záizar H., Aguilar-López L., Esparza-Flores M.A., López-Guido B., et al. Frequency of intron 1 and 22 inversions of factor viii gene in Mexican patients with severe hemophilia A. Am J Hematol 2007; 82: 283–7.

23. De Brasi C., Candela M., Cermelj M., Slavutsky I., Larripa I., Bianco R.P., et al. Intron 22 factor VIII gene inversions in Argentine families with severe haemophilia A. Haemophilia 2000; 6: 21–2.

24. Corrêa M.C.S.M., Ferreira E., Veiga M.T.A., Bandinelli E., Rosset C. Prevalence of inversions in introns 1 and 22 of the factor VIII gene and inhibitors in patients from southern Brazil. J Bras Patol Med Lab 2019; 55 (6): 598–605.

25. Бескоровайная Т.С., Миловидова Т.Б., Щагина О.А., Рыжкова О.П., Поляков А.В. Комплексная диагностика гемофилии А у российских больных. Генетика 2019; 55 (8): 1015–24.

26. Pio S.F., Oliveira G.C., Soares S., Rezende S.M. An aberrant pattern for intron 1 inversion of factor VIII gene. Haemophilia 2011; 17: 703–20.

27. Sanna V., Ceglia C., Tarsitano M., Lombardo B., Coppola A., Zarrilli F., et al. Aberrant F8 gene intron 1 inversion with concomitant duplication and deletion in a severe hemophilia A patient from Southern Italy. J Thromb Haemost 2013; 11: 195–7.

28. Badoz M., Pellechia D., Fretigny M. Unusual intron 1 inversion with concomitant large duplication within the F8 gene in a severe haemophilia A patient. J Thromb Haemost 2009; 7: 807.

29. Stefanovska E.S., Dejanova V., Tchakarova P., Petkov G., Efremov G.D. Genetic Inversions among Hemophilia A Patients from Macedonia and Bulgaria. Acta Haematol 2008; 120: 192–4.

30. You G., Chi K., Lu Y., Ding Q., Dai J., Xi X., et al. Identification and characterisation of a novel aberrant pattern of intron 1 inversion with concomitant large insertion and deletion within the F8 gene. Thromb Haemost 2014; 112 (2): 264–70.

31. Jourdy Y., Fretigny M., Nougier C., Négrier C., Bozon D., Vinciguerra C. Splicing analysis of 26 F8 nucleotide variations using a minigene assay. Haemophilia 2019; 25 (2): 306–15.

32. Vidal F., Farssac E., Altisent C., Puig L., Gallardo D. Rapid Hemophilia A Molecular Diagnosis by a Simple DNA Sequencing Procedure: Identification of 14 Novel Mutations. Thromb Haemost 2001; 85 (4): 580–3.

33. El-Maarri O., Herbiniaux U., Graw J., Schröder J., Terzic A., Watzka M., et al. Analysis of mRNA in hemophilia A patients with undetectable mutations reveals normal splicing in the factor VIII gene. J Thromb Haemost 2005; 3 (2): 332–9.

34. CDC Hemophilia Mutation Project (CHAMP & CHBMP) [Electronic resource]. Available at: https://www. cdc.gov/ncbddd/hemophilia/champs. html (accessed December 15, 2020).

35. Factor VIII Gene (F8) Variant Database [Electronic resource]. Available at: https://f8-db.eahad.org/index.php (accessed December 15, 2020).

36. Green P.M., Bagnall R.D., Waseem N.H., Giannelli F. Haemophilia A mutations in the UK: results of screening one-third of the population. Br J Haematol 2008; 143: 115–28.